Saturs
Agarozes želejas izgatavo zinātnieki, kas strādā molekulārās bioloģijas laboratorijās, lai izpētītu DNS fragmentus, kas modificēti eksperimentālā darba laikā. Agarozes gēla izgatavošanas metode ir pamatprasme, kas jāapgūst visiem pētniekiem, jo tā ļauj tieši vizualizēt dažādus DNS lielumus verifikācijai un gēnu klonēšanas projektiem. Lai gan gēla sagatavošana nav sarežģīta, tāpat kā visās laboratorijas procedūrās, to drīkst pārbaudīt tikai profesionāli, kas ir zinātniski apmācīti sakarā ar bioloģiskajiem riskiem.
Instrukcijas
-
Pārliecinieties, ka gēla bāzēm nav plaisas vai nekas, kas var izraisīt karstā agarozes noplūdi. Notīriet paplātes ar 70% alkoholu un ļaujiet tai pilnībā izžūt. Pamatnei ir divi atvērti galiņi un divi noslēgti gali. Dažos formātos kopā ar tiem tiek pievienoti klipi, lai aizvērtu galus, bet lielākā daļa ir jāaizzīmē, ievietojot lentes sloksnes starp atklātām daļām. Nostipriniet lenti stingri un droši, jo tie var virzīties prom no turētāja un ļaut karstajai agarozei noplūst.
-
Pamatojoties uz atdalāmā DNS fragmenta lielumu un analizējot ar agarozes gelu, nosakiet nepieciešamo procentuālo daudzumu. Piemēram, pie 1% (w / v) agarozes gēls būs efektīvs, analizējot 0,5 līdz 10 kb DNS segmentus. Jo lielāks ir procentuālais daudzums (vairāk agarozes), jo mazāki ir fragmenti, kurus var atdalīt. Parastie eksperimenti izmanto 0,5% līdz 2% agarozes. 1% agarozes gela svarā 1 g agarozes pulvera nosver ķīmiskā apstrādē vai citā izolācijas sistēmā. Uzmanīgi pārvietot uz gela laboratorijas sagatavošanas vietu.
-
Attiecīgajā gela sagatavošanas zonā izmēra 100 ml elektroforēzes bufera. Tam jābūt istabas temperatūrā. Agarozes pulveri pārnes ugunsdrošā kolbā un ielej izmērīto elektroforēzes bufera tilpumu. Uzmanīgi karsējiet maisījumu mikroviļņu krāsnī, bet ne vāra, jo iztvaikošana var mainīt klātbūtnes agarozes procentu. Pārliecinieties, ka visa agaroze ir izšķīdusi, sakrata, lai rūpīgi samaisītu, nedaudz atdzesē un tad pievieno 0,5 mikrogramus uz mililitru etīdija bromīda. Neieelpojiet tvaikus, jo tas var kairināt plaušas un gļotādas audus. Pēc tam, kad etīdija bromīds ir pievienots, neuzsildiet šķīdumu. Vēlreiz sakratiet, lai samaisītu, un tad, kamēr šķīdums joprojām ir pietiekami karsts, lai izšļakstītos, izšķīdiniet to sagatavotajā pamatnē. Ņemiet vērā, ka, ja ir liels parauga tilpums vai neliela DNS koncentrācija, var būt biezāks gēls. Tomēr smalkākos gēlus ir vieglāk analizēt, jo tie būs skaidrāk fotografēti.
-
Ievietojiet ķemmes želejā, lai izveidotu rievas vai urbumus novietojamam paraugam. Ļaujiet tai atdzist līdz istabas temperatūrai vairākas stundas vai ledusskapī dažas minūtes. Pēdējā gadījumā, kad gēls ir gatavs, jāievēro agarozes kristālu klātbūtne. Parasti tās izzūd, ja želejai dažu minūšu laikā pirms lietošanas ir atļauts sasilt istabas temperatūrā. Uzmanīgi noņemiet ķemmes, lai nenoplēstu želeju vai izjauktu akas. Agarozes gēls tagad ir gatavs lietošanai. Ja to neizmanto nekavējoties, tas būs jāiesaiņo celofānā vai jāuzglabā ledusskapī plastmasas traukā, lai novērstu izžūšanu vai kausēšanu.
Agarozes gela sagatavošana
Paziņojums
- Izmantotie reaģenti ir iespējamie kancerogēni, un tos jārīkojas uzmanīgi un pienācīgi. Ja gēla sagatavošanas laikā tiek pieļauta kļūda, to nekad nedrīkst atkārtoti uzsildīt, bet atcelt un vēlreiz sagatavot jaunu gēlu.
Kas jums nepieciešams
- Agarozes pulveris elektroforēzei
- TAE vai TBE buferis
- Etidija bromīda šķīdums
- Gēla bāze
- Lentes vai gēla pamatnes klipi
- Gēla ķemmes
- Svari un patēriņa preces
- Etanols
- Laboratorijas dvieļi
- Individuālie aizsardzības līdzekļi