Gēla elektroforēzes traucējummeklēšana

Video: Gel electrophoreses common mistakes #1

Saturs

Instrukcijas
Kā
Paziņojums
Kas jums nepieciešams

Poliakrilamīda gēla elektroforēze vai PAGE ir metode, ko izmanto organisko molekulu atdalīšanai bioloģiskajā paraugā. Mazāka izmēra un svara molekulas straujāk migrē poliakrilamīda gēlā, kad tiek izmantota elektriskā strāva. Asas atšķirīgas joslas parasti novēro pēc pabeigta gēla inkubēšanas vietas. Tā ir samērā vienkārša metode. Tomēr joslu, izplūdušo joslu vai neskaidru joslu neesamība var norādīt uz problēmu vienā vai vairākos metodes posmos. Jums jāievēro pamatnorādījumi, lai atrisinātu gēla elektroforēzes metodes problēmas, kurās rezultāti nav tādi, kā gaidīts.

Instrukcijas

Gēla elektroforēze ir kopēja metode proteīnu vai DNS paraugu atdalīšanai (Jupiterimages / Comstock / Getty Images)

Sāciet ar gēla elektroforēzes pēdējo soli un strādāt ar atpakaļejošu spēku. Gēla elektroforēzes gadījumā pēdējais solis ir krāsošanas procedūra, ko izmanto, lai novērotu parauga joslas. Nedaudz problēmu vajadzētu rasties krāsošanas procesā. Tomēr traipu krāsai jābūt labi izšķīdinātai attiecīgajā buferšķīdumā, pirms tas tiek izmantots gēla krāsošanai. Pārbaudiet, vai ir izmantota pareiza krāsu koncentrācija.
Pārbaudiet strāvas avotu. Joslu trūkums var norādīt, ka strāvas vai sprieguma konfigurācija ir pārāk augsta, un testa paraugi migrē no želejas. Augsti iestatījumi var arī izraisīt parauga sastāvdaļu pārcelšanos caur gēlu pārāk ātri, kā rezultātā rodas slikta izšķirtspēja un neskaidras joslas. Ja barošanas avota konfigurācija ir zema, paraugi nedrīkst pārvietoties pa gēlu. Paraugi var uzkrāties arī traukā, kur tie tika ielādēti, un nemetē caur gēlu.
Pārbaudiet šķidro akrilamīdu, ko izmanto poliakrilamīda gela pārveidošanai. Parasti akrilamīda procentuālais daudzums, ko izmanto poliakrilamīda gela pārveidošanai, ir robežās no 5% līdz 15%. Paraugi, kas sastāv no lielākām molekulām, tiek ielādēti uz 5% gela, jo lielie fragmenti gēlā pārvietojas lēnāk ar lielāku akrilamīda procentuālo daudzumu. Mazas molekulas tiek ielādētas augstākā gēla procentos, jo neliela gela koncentrācija nespēs apstrādāt mazākus paraugus.
Pārbaudiet reaģentus, ko izmanto akrilamīda polimerizācijai. Poliakrilamīda gelu veido polimerizējot šķidru maisījumu, kas sastāv no bis-akrilamīda un akrilamīda. Lai katalizētu gēla veidošanos, akrilamīdam pievieno amonija persulfātu un TEMED. Parasti akrilamīdam jāparādās polimerizācijas pazīmēm (gēla veidošanās) 15 minūtes pēc amonija persulfāta un TEMED pievienošanas. Ļoti strauji notiek polimerizācija, ko izraisa liels amonija persulfāta daudzums. Ja tas nav pietiekams, tas var izraisīt nepilnīgu vai nevienmērīgu polimerizāciju.
Apstipriniet ielādēto paraugu daudzumu. Augstas paraugu koncentrācijas var pārvietoties lēni caur želeju un samazināt joslas izšķirtspēju. Zema parauga koncentrācija var nebūt novērojama pēc gēla iekrāsošanas. Šīs krāsvielas ierobežo minimālo parauga daudzumu, ko var vizualizēt krāsu jutības rezultātā.
Apstipriniet ielādēto paraugu kvalitāti. Sāls un citi piemaisījumi, kas atrodas paraugā, var ietekmēt parauga kustību pa gēlu. Elektroforēze ir elektriskās strāvas pārneses rezultāts caur gelu, kas satur vadošu strāvas buferi; augstās sāļu koncentrācijas paraugā var ietekmēt šīs strāvas kustību caur gēlu. Izolējot paraugu, jāievieto attīrīšanas komplekts, lai iegūtu salīdzinoši tīru paraugu.
Pārskatiet literatūru vai rakstisko protokolu, lai noteiktu, vai eksperimenta veikšanai tika izmantots pareizais "PAGE". Akrilamīda procentuālais daudzums "PAGE" ir specifisks pārbaudāmā parauga lielumam. Literatūrā var sniegt arī specifisku informāciju par enerģijas avota izveidi un parauga migrācijas ātrumu.

Kā

Sniegtās vadlīnijas ir vispārīgas attiecībā uz lietojumiem bioloģiskajā pētniecībā.
Lai atrisinātu jebkuru laboratorijas procedūru, vislabāk ir sākt ar pēdējo soli un strādāt ar atpakaļejošu spēku, lai noteiktu problēmu.

Paziņojums

Apstrādājot akrilamīdu un poliakrilamīdu, valkājiet cimdus. Akrilamīds ir neirotoksisks reaģents un var absorbēties caur ādu. Poliakrilamīds nav neirotoksisks, tomēr tas bieži satur polimerizētu akrilamīdu un joprojām var būt toksisks.